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Cell報(bào)道 | 西湖大學(xué)發(fā)現(xiàn)艱難梭菌毒素入侵人體“新大門”

科學(xué)研究有時(shí)候就像福爾摩斯破案，面對看不見摸不著的對手，需要大膽假設(shè)，小心求證，外加細(xì)致入微的觀察。

“艱難梭菌”就是陶亮博士的對手之一。這是一種造成醫(yī)院和社區(qū)感染腹瀉及腸炎的重要病原體，近年來在全球各地造成了一系列爆發(fā)性感染，被美國疾病預(yù)防控制中心列為最高級別威脅的耐藥病菌。

陶亮對此跟蹤研究了9年。從2013年在哈佛醫(yī)學(xué)院做博士后至今，他一直在研究包括艱難梭菌在內(nèi)的病原細(xì)菌與宿主之間的相互作用。簡單說，就是解釋艱難梭菌如何入侵人體并致病。

現(xiàn)在，他們有了新的重要發(fā)現(xiàn)。

北京時(shí)間2022年3月17日23點(diǎn)，西湖大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院陶亮團(tuán)隊(duì)與施一公團(tuán)隊(duì)合作，在《細(xì)胞》（Cell）在線發(fā)表題為“TFPI is a colonic crypt receptor for TcdB from hypervirulent clade 2?C. difficile”的最新研究成果，首次揭示了超毒力分支艱難梭菌毒素B的腸道上皮受體——TFPI蛋白。

這意味著，他們發(fā)現(xiàn)了艱難梭菌毒素B入侵人體的新“大門”。

論文鏈接：https://authors.elsevier.com/a/1elpeL7PXingP（該全文下載鏈接50天內(nèi)有效）

論文截圖

對手

為什么盯上艱難梭菌？

艱難梭菌是一種厭氧的革蘭氏陽性細(xì)菌，因?yàn)榉蛛x培養(yǎng)比較困難，所以得名“艱難”。它普遍存在于環(huán)境中，包括空氣、水、土壤、動物和人類的糞便中。而人體腸道內(nèi)也是一個它適合定居的場所。

艱難梭菌感染之所以如此嚴(yán)重，抗生素的濫用難辭其咎。當(dāng)長期使用抗生素，破壞人體正常腸道菌群時(shí)，艱難梭菌就會乘虛而入，大量繁殖，引發(fā)偽膜性腸炎、腹瀉、腸穿孔等多種疾病癥狀，嚴(yán)重時(shí)會威脅生命。

過往研究表明，艱難梭菌有5個主要的進(jìn)化分支，包括Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型，其中II型分支由于其強(qiáng)致病性，又被稱為“超毒力分支”，是近年來在北美、歐洲等地區(qū)造成數(shù)次爆發(fā)性感染的罪魁禍?zhǔn)住?br />
艱難梭菌會產(chǎn)生三種毒素 ：毒素 A、毒素 B 和二元毒素。其中，毒素B（TcdB）是艱難梭菌致病的關(guān)鍵“武器”，而不同分支產(chǎn)生的毒素B，則又分屬不同的亞型（以TcdB1、TcdB2等方式標(biāo)注）。

發(fā)現(xiàn)

它從“另一扇門”入侵人體

此前，陶亮團(tuán)隊(duì)關(guān)于經(jīng)典型的艱難梭菌毒素B在腸道上皮細(xì)胞中受體的研究工作，獲得了業(yè)內(nèi)廣泛的關(guān)注和認(rèn)可。他們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了TcdB1、TcdB3、TcdB5重要的宿主細(xì)胞受體——FZD蛋白（注，F(xiàn)ZD蛋白也是重要的WNT信號通路的受體）?？梢院唵卫斫鉃?，他們已經(jīng)破解了部分TcdB是如何通過 “大門”進(jìn)入腸道上皮細(xì)胞的。

但作為另一大“毒王”，“超毒力分支的艱難梭菌”專有表達(dá)毒素B的兩種變體（亞型）——TcdB2和TcdB4，均不識別FZD蛋白。

不知道“大門”在哪里，這兩種毒素變體又是如何進(jìn)入細(xì)胞中的？

論文圖文摘要

陶亮團(tuán)隊(duì)嘗試敲除細(xì)胞中的FZD蛋白（經(jīng)典受體），細(xì)胞依然對TcdB4高度敏感。他們猜測，一定存在“另一扇門”——即某種未知受體介導(dǎo)了變體的毒素B入侵細(xì)胞。

利用一種名為CRISPR/Cas9的基因敲除文庫篩選技術(shù)，陶亮團(tuán)隊(duì)排查出了一系列相關(guān)的候選因子，即“懷疑對象”。經(jīng)過分析后，他們鎖定了一個名為組織因子途徑抑制因子（TFPI）的蛋白，認(rèn)為這個存在于細(xì)胞表面的蛋白“涉案”可能性最大，很可能就是這兩種毒素B變體進(jìn)入細(xì)胞的“另一扇門”。

求證

TFPI就是隱匿已久的新通道

為了驗(yàn)證這一猜想，研究團(tuán)隊(duì)思維縝密地設(shè)計(jì)并進(jìn)行了各種不同類型的實(shí)驗(yàn)。

關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)之一，敲除TFPI這扇“大門”，看TcdB4是否還能闖入細(xì)胞。

TFPI在哺乳動物中存在α和β兩種主要的同源異構(gòu)體，兩種形式都具有介導(dǎo)TcdB4進(jìn)入細(xì)胞的能力。由于TFPI全敲除會導(dǎo)致小鼠死亡，研究團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了TFPIβ敲除的小鼠。隨后對小鼠進(jìn)行腹腔注射TcdB4進(jìn)行毒素挑戰(zhàn)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)有超過60%的純合型（TFPIβ?/?）小鼠存活了下來?！白C明TFPI是TcdB4的關(guān)鍵受體，并且顯示了腎臟是全身系統(tǒng)感染下的主要受損器官”，陶亮說。

TcdB4和TFPI形成復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)圖

關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)二，從分子水平直接“看到“毒素和受體的結(jié)合。

陶亮團(tuán)隊(duì)與施一公團(tuán)隊(duì)的李顏顏研究員等開展合作，利用冷凍電鏡單顆粒三維重構(gòu)技術(shù)，解析了分辨率為3.1?的毒素-受體復(fù)合物（TcdB4-TFPI）的三維結(jié)構(gòu)。

隨后，通過對比， 研究團(tuán)隊(duì)對艱難梭菌毒素B進(jìn)入細(xì)胞的路徑進(jìn)行了歸類：第一類以TcdB1/3/5為代表，從FZD這扇“大門”進(jìn)入；第二類主要包含“超毒力分支”的TcdB2和TcdB4，選擇通過TFPI這扇“大門”進(jìn)入。

(A) 毒素-受體復(fù)合物TcdB1-FZD2與TcdB4-TFPI的結(jié)構(gòu)比較。(B) 系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)TcdB基于受體結(jié)合區(qū)域差異可分為兩大類，分別識別FZD和TFPI。(C) 艱難梭菌分支I、III、IV、V的TcdB識別FZD作為受體，超毒力分支II的TcdB識別TFPI作為受體。

關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)三，構(gòu)建“TFPI誘餌”誘捕毒素，看能否保護(hù)細(xì)胞和實(shí)驗(yàn)動物不受傷害。

研究團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了一種“TFPI誘餌”——即含有TFPI部分關(guān)鍵區(qū)域的可溶性蛋白——來迷惑并誘捕毒素分子。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，無論是在細(xì)胞水平還是小鼠模型中，這類“TFPI誘餌”都可以有效阻止超毒力分支艱難梭菌的毒素B的破壞，起到了顯著的保護(hù)作用。“這不僅進(jìn)一步證實(shí)TFPI是超毒力艱難梭菌的TcdB在腸道上皮中的受體，更預(yù)示了可溶性TFPI作為中和蛋白在防治超毒力艱難梭菌感染中的潛在應(yīng)用價(jià)值?！碧樟两忉屨f。

如前文所述，艱難梭菌的特性使其在抗生素治療時(shí)效果較差且復(fù)發(fā)嚴(yán)重。而基于受體的靶向開發(fā)，比如中和抗體，是一類路線不同的新策略，理論上說靶點(diǎn)更加精準(zhǔn)，對人體和環(huán)境帶來的負(fù)面影響也更小。

這項(xiàng)研究對于揭示和理解艱難梭菌感染的致病機(jī)制、及梭菌大毒素的進(jìn)化和工作方式方面有著重要科學(xué)意義，并且為超毒力分支菌株引起的艱難梭菌感染的預(yù)防和治療新方法的開發(fā)提供了重要的理論依據(jù)。

西湖大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院的陶亮研究員（Lead Contact）和李顏顏研究員（施一公團(tuán)隊(duì)）為本文的共同通訊作者；西湖大學(xué)博士后羅建華、博士生楊琦、博士后張曉峰、科研助理張媛媛、博士后萬里為共同第一作者。其它合作作者包括西湖大學(xué)的研究員黃晶博士和甄瑩博士，博士后占謝超，博士研究生周瑤、賀柳晴、李丹陽，和杭州醫(yī)學(xué)院的研究員金大智博士。此外還特別感謝波士頓兒童醫(yī)院/哈佛醫(yī)學(xué)院的董民教授和西湖大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院李黨生教授在項(xiàng)目進(jìn)行過程中的支持與討論。本課題受到國家自然科學(xué)基金、浙江省自然科學(xué)基金、西湖實(shí)驗(yàn)室（生命科學(xué)和生物醫(yī)學(xué)浙江省實(shí)驗(yàn)室）及西湖教育基金會的資助；項(xiàng)目實(shí)施還得到了西湖大學(xué)生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)中心、實(shí)驗(yàn)動物中心和高性能計(jì)算中心的支持和幫助。

陶亮課題組簡介與招聘信息

西湖大學(xué)微生物宿主交互實(shí)驗(yàn)室（實(shí)驗(yàn)室主頁：https://tao.lab.westlake.edu.cn/）致力于研究微生物-宿主之間的相互作用方式和內(nèi)在規(guī)律，尤其是從分子、生化、細(xì)胞、生信、結(jié)構(gòu)等方面研究重要病原細(xì)菌及其致病因子對宿主的影響及作用機(jī)制。西湖大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院研究員陶亮近年來以第一和通訊作者在Cell、Nature、Science、Cell Research、Nature Microbiology、Nature Communications、PLOS Pathogens等學(xué)科主流期刊上發(fā)表多篇學(xué)術(shù)論文。實(shí)驗(yàn)室目前有多個博士后、博士生和科研助理崗位，方向包括且不限于分子微生物學(xué)、生物信息學(xué)和微生物組學(xué)、微生物遺傳學(xué)、免疫學(xué)、結(jié)構(gòu)生物學(xué)、生物化學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)等，誠邀各方青年才俊加入、攜手共同成長?。?lián)系方式：taoliang@westlake.edu.cn）